mRNA疫苗体外合成完整解决方案

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随着生命科学的不断进步，mRNA作为药物被应用到疾病治疗、疫苗等领域。从1990年体外合成的mRNA第一次在细胞内表达，到2020年的mRNA疫苗在对抗新冠疫苗发挥重要作用。以mRNA为基础的治疗方式已经在医药领域引起了一场革命。

mRNA（Messenger RNA、信使RNA）是将DNA中的基因信息传递到蛋白的中间信使。mRNA疫苗治疗（见下图）是指在体外合成mRNA，将其导入体内，mRNA进入细胞后翻译表达出抗原蛋白，抗原刺激体内免疫系统，激活体液免疫和细胞免疫，当机体再次接触同种抗原（细胞/病毒），可产生快速免疫应答反应，自我保护。

mRNA疫苗研发-生产-治疗流程

图片引用于 Novoprotein Scientific Inc.

mRNA疫苗具有研发速度快、灵活、生产工艺简单、平台化、容易扩充产能，可以用于精准化和个性化治疗，一次可呈递多种抗原等优点。mRNA疫苗属于第三代疫苗技术（见下图），相比于传统疫苗需要通过将病原微生物及其代谢产物通过人工灭毒﹑减活﹑基因工程的方法制成的繁杂工序，第三代疫苗特异性更强，有效性更高，并且研发周期较快。它的结构简单、可人工批量合成，并且可以在研发阶段进行高通量筛选，大大节省研发时间。而且相较于DNA疫苗，mRNA疫苗没有导入外源基因的遗传风险，起效更快，效果更强。

mRNA疫苗相对于其他疫苗的优势  图片引用于网络

 mRNA疫苗具有工艺通用性好，研发速度快，能够活化细胞免疫，刺激效果好，递送效果好等特性。高的mRNA产量需要高效的mRNA体外合成方法，大规模生产选择T7 RNA聚合酶体外转录。增强mRNA的稳定性，降低免疫原性并提升翻译效率，最有效的解决方案是：使用加帽酶对mRNA进行加帽，使其在细胞内外稳定，降低免疫原性，并且使mRNA可以被核糖体识别，启动翻译程序。

近岸蛋白质提供一系列mRNA体外合成酶及试剂，解决mRNA疫苗的关键痛点。所有产品均采用药用规格原辅料生产，严格控制宿主蛋白质残留、核酸残留及常见病原体污染，符合GMP规范的产品生产与质量管理规程，保障生产过程及所有原辅料可追溯。

产品特点：

GMP级mRNA体外合成及修饰原料，animal-free，ampicillin-free

产品生产、质量控制及配套文件体系，符合mRNA疫苗及药物研发生产需求

经过临床使用验证，单批次产能千万人份，年产能50亿人份

mRNA疫苗体外合成关键步骤及相关产品：

1、生成模板-质粒线性化 相关产品：Bsa I，GMP Grade（货号：GMP-RE026）

        此步将构建好的质粒酶切，处理成线性化双链DNA模板，用于下一步mRNA合成。

        限制性内切酶Bsa I 特异性识别双链DNA中位点并进行酶切，可将模板质粒酶切线性化，作为mRNA体外合成模板；

        酶切位点：

产品特点：

        强特异性

        受CpG、Dcm甲基化影响，剪切阻断

        受EcoBI甲基化影响，剪切可能受影响

        不受Dam甲基化影响

2、mRNA体外合成  相关产品：T7 RNA Polymerase, GMP Grade (货号：GMP-E121)

此步以DNA为模板，在体外由RNA聚合酶催化合成mRNA。

T7 RNA Polymerase（T7 RNA聚合酶）是高度特异识别T7启动子序列的5'→3' RNA聚合酶，以含有T7启动子序列的单链或双链DNA为模板，以NTP为底物，合成与启动子下游的单链DNA互补的RNA。T7 RNA聚合酶是体外转录mRNA的关键酶。

产品特点：

高度特异识别T7启动子

20ul反应体系，产量可达150ug

可对低至1ng模板进行有效转录

合成长度可达15k

体外转录产生的mRNA，Qsep1结果显示，纯度高，均一性好。

3、mRNA转录后修饰：加帽加尾

   此步对mRNA进行修饰，合成功能完整的mRNA。

完整mRNA结构

3.1、mRNA加帽(Cap0)   相关产品：Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade (货号：GMP-M062)        

此步与3.2同时进行，在mRNA的5'端加上Cap0帽结构。

在真核生物中，转录后的mRNA必需经过一系列修饰才能形成完整的结构，即在5'端形成一个帽子结构（Cap1），3’端形成PolyA尾结构。这些结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。

 Vaccinia Capping Enzyme（牛痘病毒加帽酶）用于给体外转录合成的mRNA催化加上帽子结构（Cap0），显著改善mRNA的稳定性和翻译能力，使mRNA可在细胞内表达蛋白，避免核酸外切酶等的降解破坏。

mRNA的帽结构是由一个7-甲基鸟苷通过一个5′–5′三磷酸酯桥连接到mRNA 链的5′核苷上组成。Cap-0结构由相邻的RNA链通过三种酶的依次反应形成。进一步形成cap-1结构需要2-O甲基转移酶（Cat. No: GMP-M072, Novoprotein）参与，该修饰可以降低RNA在体内引起的细胞先天免疫反应。

产品特点：

高效完成mRNA加帽Cap0   

提高mRNA的稳定性，防止被RNA酶降解                                                           

提高mRNA的翻译效率，提高蛋白产量

3.2、mRNA加帽(Cap1)  相关产品：mRNA 2’-O-Methyltransferase, GMP Grad e (货号：GMP-M072)

此步与3.1同时进行，在mRNA的5'端加上Cap0帽结构的基础上，再将Cap0转化为Cap1结构。

真核生物中，mRNA的转录后须经系列修饰，在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，3’端形成PolyA尾结构。这些结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。已知Cap1结构存在于所有真核生物mRNA，在稳定mRNA结构和提高翻译效率方面起重要作用。研究表明，体外转录修饰得到的Cap1结构mRNA更不容易被免疫系统的RNA感受器（RIG-I）识别，因此免疫刺激更低。

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferas （2´-O-甲基转移酶）可利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体， 在 RNA 5´末端紧邻帽结构（Cap 0）的第一个核苷酸的 2´-O 上添加甲基基团，形成带有 Cap 1 结构的 mRNA。Cap1 结构能增强 mRNA 的翻译效率，从而可提高转染后 mRNA 编码的蛋白表达水平。该酶只能以带 7-甲基鸟苷帽结构（m7GpppN）的 RNA 为底物，不会作用于 5´末端为pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。带 7-甲基鸟苷帽结构（m7GpppN）的 RNA 可通过 Vaccinia Capping System（Cat. No: GMP-M062, Novoprotein）来制备。

产品特点：

使mRNA的Cap 0帽子甲基化为 Cap 1帽子

提高 RNA 的翻译效率，提高蛋白产量

进一步降低免疫原性

完整mRNA在细胞内表达GFP蛋白，加帽酶与帽类似物对比

3.3、mRNA加尾(PolyA)  相关产品：E. coli Poly(A) Polymerase, GMP Grade (货号：GMP-M012)

此步在mRNA的3'端加上PolyA尾。

真核生物中，mRNA的转录后须经系列修饰，在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，3’端形成PolyA尾结构。这些结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。Poly A与成熟mRNA的稳定性、翻译起始以及出核运输有关，体内转录后修饰中，polyA聚合酶在RNA 3’-OH上逐一引入100-200个A碱基。

体外转录RNA过程中，E. coli Poly (A) Polymerase（加尾酶） 不依赖模板的存在，可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次掺入到 RNA 的 3´末端，即在 RNA 的 3´末端加多聚 A 尾。Poly (A) 聚合酶具有很高的加尾效率，可以在 RNA 的 3´末端加入 20~200 个 A 碱基。最大程度还原体内加尾过程。

产品特点：

稳定mRNA的存在形式

引导转录终止

提高RNA在真核细胞中的翻译效率

4、其他相关产品

4.1、防止mRNA降解  相关产品：RNase inhibitor, GMP Grade (货号：GMP-E125)

在流程2-3 mRNA合成与修饰中加入RNase Inhibitor，防止RNA降解。

RNase Inhibitor可与RNase  A形成1：1复合体，对RNase 有极强非竞争性抑制，保护mRNA转录后不被降解

产品特点：

强抑制RNase活性

稳定性强

4.2、降解模板DNA  相关产品：DNase I, GMP Grade (货号：GMP-E127)

        在流程2 RNA合成结束后，去除模板DNA。

DNase I将单链或双链DNA随机分解。

DNase I 去除RNA样本种的DNA残留

4.3、增加mRNA产量  相关产品：Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade (货号：GMP-M036)

        在流程2 RNA合成过程中加入无机焦磷酸酶，增加RNA产量。

        无机焦磷酸酶PPase（Pyrophosphatase, Inorganic）可催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐（P2O7-4+H2O+PPase→2HPO4-2），一方面可去除无机焦磷酸盐对反应体系的抑制，另一方面为反应提供热力学动力，促进产物的生成。常用于RNA、DNA、蛋白质的生物合成中，是一种良好的辅剂，在mRNA疫苗体外大规模合成中加入可显著提高产量。

无机焦磷酸酶去除mRNA合成过程中产生的焦磷酸，提高mRNA产量。

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